心肌梗死（MI）是缺血性心脏病的一种主要形式，心脏缺血后再灌注，是恢复缺血组织供血/供氧最有效的治疗方式，但会因缺血再灌注损伤（IRI）加剧心肌损伤。中国医学科学院阜外医院王利教授团队在 Circulation Research （IF=16.5/Q1）上发表了题为“Spatial Multiplexed Protein Profiling of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury”的文章，利用组织成像质谱流式（IMC）技术，绘制了 IRI 后小鼠心脏单细胞蛋白修饰的时空图谱，并发现内皮细胞中的 H3K9me3 可作为潜在治疗靶点。

先前已有研究使用 scRNA-seq 对 IRI 所涉及到的细胞类型复杂的异质性进行探索，但该技术不能保存细胞在组织内的空间信息；另一方面，常规转录组分析无法在单细胞层面上研究蛋白质翻译后修饰。组织成像质谱流式（IMC）技术是一种新兴的空间高分辨率单细胞蛋白分析技术，能够同时检测多种蛋白质及其翻译后修饰（PTMs），为研究细胞间的空间关系和动态变化提供了强有力的工具。IMC 利用稀有金属标签代替传统的荧光标记抗体，在切片染色之后，通过飞行时间质谱检测，以区分不同的金属标签，便可在单张切片上同时检测几十种靶标蛋白。该技术无需循环染色可彻底解决荧光通道串扰的问题，并且具有多通道、低背景噪音、高数据质量等特点。本研究中使用了 29 个抗体，包括细胞类型标志物、与再灌注损伤相关的激酶通路以及甲基化、乙酰化等组蛋白修饰的靶标。

IMC 检测的 29 个抗体靶标

为了充分描绘 IRI 随时间和空间的变化过程，研究共选取了小鼠心脏 12 个心脏节段：基底部（Basal）、中部（Mid-cavity）、心尖部（Apical）和心尖（Apex）以及每个部分的前壁（Anterior）、侧壁（Lateral）和下壁（Inferior）。同时选取心肌缺血过程的 8 个时间点：缺血前（I-0H），缺血再灌注后的 0 小时（R-0H）、2 小时（R-2H）、6 小时（R-6H）、12 小时（R-12H）、1 天（R-1D）、3 天（R-3D）、7 天（R-7D）。经 IMC 检测后，共获得了 251 张图像，识别出 197063 个细胞，包括：心肌细胞（CM）、内皮细胞（EC）、成纤维细胞（FB）、巨噬细胞（MP）和平滑肌细胞（SMC）等。研究发现，伴随心肌缺血的过程，成纤维细胞表现出与心肌细胞相反的变化趋势，心肌细胞显著损伤，而相同区域内，纤维化程度明显。在早期缺血和 IRI 晚期病理重塑过程中，内皮细胞特定位置出现两次反应性增多。这些结果与已知病理过程一致，也说明利用 IMC 技术，可以有效追踪 IRI 心脏细胞变化的规律。

作者首先利用细胞核的概率图和 CellProfiller 单细胞化工具识别出组织图像中的每个细胞，从而得到单细胞水平的 marker 表达数据。随后使用基于单元位置信息的 Louvain 群落检测算法，应用 PhenoGraph 将先前使用不同细胞类型的比例对群落进行聚类，确定 23 个不同的细胞群落簇（Community Clusters, CCs）。其中大多数 CCs 中的主要细胞类型为心肌细胞，有三个 CCs 中最多的是成纤维细胞，另外有六个 CCs，分别富了集更的内皮细胞和平滑肌细胞。分析发现 CCs 与局部组织结构有明显关联，集中体现在不同 CCs 距离不同类型血管的远近上。

为了说明健康心肌局部细胞网络的空间分布模式，作者系统地评估了所有 12 个心肌节段的细胞结构，几乎所有节段都存在心肌细胞蛋白丰富的 CCs。除基底节外，CCs 的多样性从前壁到下壁呈逐渐减少的趋势，前部的细胞结构最为复杂。总的来说，这些结果显示了左心室游离壁内高度异质性和空间结构上定义出的细胞群落。

确定了正常心脏左心室的细胞表型之后，作者比较正常心脏和 IRI 后心脏的 CCs 的变化，发现损伤后 CCs 发生了快速改变，梗死区域、边缘区域和遥远区域的变化趋势也并不相同。这不仅揭示了 IRI 病理反应的空间异质性，也说明了研究不同解剖位置（空间结构）的重要性。

为了揭示 IRI 发病进展过程中，关键的信号传导和表观遗传事件，作者在所有组织位置和时间点的样本上，利用组蛋白的 7 种磷酸化激酶表达和 14 种组蛋白修饰的 IMC panel 进行检测，发现激酶信号的激活主要存在梗死的边缘区（Mid-ant），且组蛋白修饰表现出不同修饰模式。接下来，作者通过无监督聚类，生成了 13 个翻译后修饰的表达簇（Posttranslational Modification Intensity, PTMI），以此探索细胞类型 PTM 的特征和时空变化中细胞结构之间的关系。在 IRI 中期，PTMI-1、PTMI-7 和 PTMI-10 这三个表达簇是从 Mid 到 Apex 段信号较强的 PTMI，且其中的内皮细胞比例逐步增加。而在内皮细胞的特定 PTM 信号中，发现 PTMI-10 中的 H3K9me3 修饰在内皮细胞中明显增加，综上表明，H3K9me3 在 IRI 有关的内皮细胞中应激水平增高。另外，还发现 IRI 的晚期变化，与成纤维细胞主导的 CCs  相关。

最后，作者发现，通过抑制 H3K9me3 后的内皮细胞可改善 IRI。在冠状动脉左前降支（LAD）结扎模型小鼠的 R-0H 时刻，将表观基因修饰的内皮细胞（modECs）注射到心脏梗死区。注射后 21 天，相较于对照组，梗塞心脏的心功能有所改善——血管生成增多，而纤维化明显降低。此外，作者还通过 RNA-seq 及 ChIP-seq 技术发现，H3K9me3 可直接调控内皮细胞中相关功能基因的表达，从而改善 IRI 的预后结局。因此，H3K9me3 有望成为 IRI 干预的新靶点。

综上所述，本研究利用高通量的抗体染色成像质谱流式技术—— IMC，通过对翻译后修饰蛋白的单细胞表达及其在 IRI 期间的动态变化进行系统性研究。揭示了 IRI 期间细胞组成的变化，并在此基础上，绘制了单细胞分辨率下 IRI 后小鼠心脏细胞类型变化以及翻译后修饰的时空图谱，同时，作者发现了可能对 IRI 后重塑至关重要的翻译后修饰调节反应。该研究发现的潜在干预新靶点，有望为未来临床治疗 IRI 提供理论依据。

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【参考文献】

Spatial Multiplexed Protein Profiling of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury，Circulation Research. 2023;133:86–103. 

DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.123.322620